賽默飛熒光定量PCR儀使用方法

賽默飛熒光定量PCR儀（如 QuantStudio 系列、ABI 7500 系列）廣泛用于基因表達(dá)分析、病原體檢測、基因分型等實(shí)驗(yàn)。以下是熒光定量PCR儀的標(biāo)準(zhǔn)操作方法，幫助您完成實(shí)驗(yàn)。

1. 儀器操作前的準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1. 確定實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)：

• 基因表達(dá)定量、病原體檢測、SNP分析等。

2. 選擇合適的試劑體系：

• 使用 TaqMan 探針、SYBR Green 染料或其他符合實(shí)驗(yàn)需求的反應(yīng)體系。

實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備

• 樣本模板（如 DNA、RNA 經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄的 cDNA）。

• 引物和探針（設(shè)計(jì)特異性高的引物和探針）。

• PCR 反應(yīng)試劑（如 Taq 酶、dNTPs）。

• PCR 反應(yīng)板（96孔或384孔，依儀器型號選擇）或 PCR 管。

• 無菌操作工具（如移液器、濾芯吸頭）。

檢查儀器狀態(tài)

• 確保熒光定量PCR儀已正確連接電源并開機(jī)。

• 檢查儀器是否校準(zhǔn)，包括光學(xué)通道和溫控模塊。

• 清潔樣本托盤，避免污染。

2. 樣本和反應(yīng)混合物的制備

標(biāo)準(zhǔn) PCR 反應(yīng)體系（以 20 µL 反應(yīng)體系為例）：

步驟：

1. 在無菌環(huán)境下混合所有反應(yīng)成分，輕輕振蕩均勻，避免氣泡產(chǎn)生。

2. 將混合好的反應(yīng)液分裝至 96 孔 PCR 板或 0.2 mL PCR 管中。

3. 在每個(gè)孔/管上覆蓋光學(xué)透明封板或封膜，防止蒸發(fā)。

4. 確保每孔的體積一致，以避免離心過程中不平衡。

3. 熒光定量PCR儀操作步驟

1. 啟動儀器

• 按儀器型號啟動，如 QuantStudio 系列或 ABI 7500 系列。

• 打開儀器配套軟件（如 QuantStudio Design and Analysis 軟件）。

2. 設(shè)置實(shí)驗(yàn)參數(shù)

1. 選擇實(shí)驗(yàn)類型：

• 絕對定量實(shí)驗(yàn)：檢測樣本中靶基因的絕對拷貝數(shù)。

• 相對定量實(shí)驗(yàn)：研究靶基因在不同樣本中的表達(dá)水平。

• 溶解曲線分析：用于區(qū)分特異性擴(kuò)增和非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。

2. 輸入實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：

• 輸入靶基因和對照基因的信息。

• 熒光染料/探針類型（如 FAM、SYBR Green）。

3. 選擇樣本板格式：

• 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇 96 孔板或 384 孔板。

• 設(shè)置每個(gè)孔的樣本名稱、反應(yīng)成分和靶標(biāo)信息。

4. 設(shè)置 PCR 程序：

• 初始變性： 95°C，2 分鐘。

• 循環(huán)反應(yīng)：

• 95°C，15 秒（變性）。

• 60°C，30-60 秒（退火和延伸），共 40-45 個(gè)循環(huán)。

• 標(biāo)準(zhǔn)熱循環(huán)程序：

• 如果是溶解曲線分析，加入升溫梯度（如從 60°C 升至 95°C）。

3. 加載樣本板

• 將已封裝好的 PCR 板或 PCR 管放入儀器樣本托盤。

• 確保板的擺放位置正確，并關(guān)閉樣本艙門。

4. 啟動運(yùn)行

• 點(diǎn)擊軟件中的 "運(yùn)行" 按鈕，啟動實(shí)驗(yàn)程序。

• 儀器開始熱循環(huán)過程，同時(shí)采集熒光信號。

4. 數(shù)據(jù)分析和結(jié)果處理

1. 實(shí)時(shí)監(jiān)測

• 儀器運(yùn)行期間，可實(shí)時(shí)觀察熒光信號累積曲線，監(jiān)控樣本擴(kuò)增狀態(tài)。

2. 結(jié)果分析

• 擴(kuò)增曲線：分析每個(gè)樣本的熒光信號累積曲線，判斷 Ct 值（循環(huán)閾值）。

• Ct 值分析：

• 定量分析靶標(biāo)的表達(dá)水平。

• 樣本濃度越高，Ct 值越低。

• 溶解曲線（SYBR Green 實(shí)驗(yàn)）：判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。

• 標(biāo)準(zhǔn)曲線分析（絕對定量實(shí)驗(yàn)）：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣本濃度。

3. 數(shù)據(jù)導(dǎo)出

• 實(shí)驗(yàn)完成后，通過軟件導(dǎo)出實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（如擴(kuò)增曲線圖、Ct 值表）。

• 數(shù)據(jù)可保存為 Excel、PDF 或其他格式，方便后續(xù)分析。

5. 儀器清潔與維護(hù)

1. 樣本艙清潔：

• 每次實(shí)驗(yàn)后，用無塵布輕輕擦拭樣本托盤，去除可能的污染物。

• 定期清潔光學(xué)模塊（如說明書所示），確保熒光檢測靈敏度。

2. 軟件維護(hù)：

• 定期更新儀器和軟件至最新版本，獲取最新功能和性能優(yōu)化。

3. 校準(zhǔn)與檢測：

• 定期校準(zhǔn)儀器光學(xué)系統(tǒng)和溫控模塊，確保數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。

• 如果儀器長期未使用，建議在正式實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行性能驗(yàn)證。

4. 安全存儲：

• 關(guān)閉儀器電源，保持設(shè)備干燥。

• 防止樣本托盤接觸過高濕度或灰塵。

注意事項(xiàng)

1. 樣本準(zhǔn)備階段：

• 嚴(yán)格避免交叉污染。

• 使用無 RNA 酶、無 DNA 酶的耗材。

• 模板樣本濃度適中，過高會導(dǎo)致抑制擴(kuò)增。

2. 反應(yīng)體系配置：

• 所有操作在冰上進(jìn)行，防止酶降解。

• 確保所有反應(yīng)組分混合均勻。

3. 實(shí)驗(yàn)運(yùn)行階段：

• 不要隨意中斷儀器運(yùn)行，避免影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

• 保證實(shí)驗(yàn)室環(huán)境穩(wěn)定，避免震動或電力波動。

總結(jié)

賽默飛熒光定量PCR儀的使用主要包括 樣本準(zhǔn)備、反應(yīng)體系配置、儀器參數(shù)設(shè)置、運(yùn)行程序以及數(shù)據(jù)分析 等五個(gè)核心環(huán)節(jié)。嚴(yán)格按照操作規(guī)范可以有效提高實(shí)驗(yàn)的成功率和數(shù)據(jù)的可靠性。實(shí)驗(yàn)完成后，定期維護(hù)儀器可確保其長期穩(wěn)定運(yùn)行。