賽默飛 QuantStudio Q5 熒光定量PCR儀操作規(guī)程

以下是 賽默飛 QuantStudio Q5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）。此規(guī)程涵蓋實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備、儀器操作、實(shí)驗(yàn)設(shè)置、運(yùn)行和數(shù)據(jù)分析的步驟。

1. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

1.1 儀器檢查

1. 確保儀器接通電源并處于正常工作狀態(tài)。

2. 打開 QuantStudio Q5 儀器和配套的軟件系統(tǒng)。

3. 檢查儀器光學(xué)模塊是否清潔，無塵無污染。

4. 確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境穩(wěn)定（溫度20-25°C，濕度40-60%），避免灰塵干擾。

1.2 反應(yīng)材料準(zhǔn)備

準(zhǔn)備 PCR 反應(yīng)所需試劑和耗材：

• 樣本模板（DNA 或 RNA 轉(zhuǎn)錄的 cDNA）。

• 引物和探針（根據(jù)靶標(biāo)基因設(shè)計(jì)）。

• 熒光定量PCR試劑（如SYBR Green Master Mix或TaqMan Master Mix）。

• 96 孔板或 0.2 mL PCR 管，以及光學(xué)透明封板或封膜。

• 無菌移液器、濾芯吸頭。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系

以下是 20 µL 體系的標(biāo)準(zhǔn)配方示例：

1.4 注意事項(xiàng)

1. 反應(yīng)體系混合時(shí)保持在冰上操作。

2. 混勻后輕微離心，避免產(chǎn)生氣泡。

3. 使用負(fù)對(duì)照（無模板對(duì)照）和正對(duì)照，確保實(shí)驗(yàn)的可靠性。

2. 儀器操作步驟

2.1 啟動(dòng)儀器

1. 打開 QuantStudio Q5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

2. 啟動(dòng)配套軟件（QuantStudio Design and Analysis Software）。

3. 選擇“新建實(shí)驗(yàn)"以創(chuàng)建實(shí)驗(yàn)文件。

2.2 實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置

1. 實(shí)驗(yàn)類型選擇：

• 絕對(duì)定量：用于計(jì)算 DNA 或 RNA 的絕對(duì)拷貝數(shù)。

• 相對(duì)定量：用于基因表達(dá)水平比較。

• 溶解曲線分析：檢查 PCR 產(chǎn)物的特異性。

• 基因分型：分析基因突變和 SNP。

2. 板型設(shè)置：

• 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇 96 孔或 384 孔板格式。

• 為每個(gè)孔輸入樣本名稱（如標(biāo)準(zhǔn)品、未知樣本、對(duì)照組）。

3. 熒光染料設(shè)置：

• 根據(jù)使用的染料或探針設(shè)置相應(yīng)的熒光通道（如 FAM、VIC、ROX）。

• 啟用 ROX 參考染料（如果試劑中包含）。

4. 熱循環(huán)程序：

• 初始變性：95°C，2-10 分鐘。

• 循環(huán)反應(yīng)（40 次循環(huán)）：

• 95°C，15 秒（變性）。

• 60°C，30-60 秒（退火和延伸，熒光信號(hào)采集階段）。

• 設(shè)置標(biāo)準(zhǔn) PCR 循環(huán)程序：

• 如果需要溶解曲線分析，加入升溫梯度（如從 60°C 至 95°C）。

2.3 加載樣本板

1. 將已封裝好的 PCR 板或管放入樣本托盤。

2. 確保 PCR 板放置平穩(wěn)，并封膜牢固，避免蒸發(fā)。

3. 關(guān)閉樣本艙門，確保儀器密封。

2.4 啟動(dòng)實(shí)驗(yàn)

1. 檢查設(shè)置無誤后，點(diǎn)擊 “運(yùn)行實(shí)驗(yàn)"。

2. 儀器開始運(yùn)行，同時(shí)采集熒光信號(hào)。

3. 在運(yùn)行過程中，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增曲線以確認(rèn)擴(kuò)增反應(yīng)正常。

3. 數(shù)據(jù)分析

3.1 實(shí)時(shí)監(jiān)控

• 儀器運(yùn)行時(shí)，軟件界面會(huì)顯示擴(kuò)增曲線的實(shí)時(shí)變化。

• 檢查所有樣本的熒光信號(hào)是否正常累積。

3.2 Ct 值分析

• Ct 值（循環(huán)閾值）： 自動(dòng)計(jì)算每個(gè)樣本的 Ct 值，Ct 值越低，樣本初始濃度越高。

• 對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于絕對(duì)定量計(jì)算樣本濃度。

3.3 溶解曲線分析（SYBR Green 實(shí)驗(yàn)）

• 檢查 PCR 產(chǎn)物是否特異性擴(kuò)增。

• 特異性擴(kuò)增應(yīng)顯示單一峰值，非特異性產(chǎn)物會(huì)有多個(gè)峰值。

3.4 數(shù)據(jù)導(dǎo)出

• 將分析結(jié)果（擴(kuò)增曲線、Ct 值表、溶解曲線等）保存為 Excel、PDF 或圖片格式。

• 確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)備份并存檔。

4. 實(shí)驗(yàn)完成后的維護(hù)

4.1 清潔儀器

1. 實(shí)驗(yàn)完成后，取出樣本板并清理托盤。

2. 用無塵布輕輕擦拭儀器內(nèi)部，防止樣本殘留。

4.2 光學(xué)模塊維護(hù)

• 定期清潔光學(xué)模塊，保持熒光檢測(cè)的靈敏度。

• 如果出現(xiàn)熒光信號(hào)異常，需校準(zhǔn)光學(xué)模塊。

4.3 溫控校準(zhǔn)

• 按照儀器使用手冊(cè)，每 3-6 個(gè)月對(duì)溫控模塊進(jìn)行校準(zhǔn)，確保溫度一致性。

4.4 軟件更新

• 定期檢查軟件版本，安裝賽默飛發(fā)布的最新補(bǔ)丁或更新。

5. 注意事項(xiàng)

1. 樣本操作

• 使用無核酸酶污染的耗材和移液器。

• 避免模板 DNA 交叉污染。

2. 試劑保存

• 熒光染料和酶類應(yīng)按照試劑說明存放（如 -20°C 冷凍）。

• 使用前確保試劑混勻。

3. 實(shí)驗(yàn)運(yùn)行

• 在運(yùn)行過程中不要隨意中斷儀器運(yùn)行，防止數(shù)據(jù)丟失。

• 若出現(xiàn)異常終止，記錄故障代碼并聯(lián)系賽默飛技術(shù)支持。

總結(jié)

賽默飛 QuantStudio Q5 熒光定量PCR儀以其靈活性和高精度著稱，是中小型實(shí)驗(yàn)室開展基因定量分析的理想工具。嚴(yán)格按照操作規(guī)程（SOP）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性，同時(shí)確保儀器的長(zhǎng)期穩(wěn)定運(yùn)行。